在生物醫(yī)學(xué)與農(nóng)業(yè)科學(xué)的交叉前沿，胚胎干細(xì)胞因其卓越的自我更新能力及分化為所有成體細(xì)胞類(lèi)型的潛能，被視為推動(dòng)疾病建模、藥物篩選、再生醫(yī)學(xué)以及家畜遺傳改良的核心工具。盡管小鼠、人類(lèi)、豬和牛的胚胎干細(xì)胞研究已取得重要突破，綿羊——這一兼具重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值和獨(dú)特生物醫(yī)學(xué)研究潛力的物種——卻長(zhǎng)期未能建立穩(wěn)定可靠的胚胎干細(xì)胞系。綿羊不僅作為主要的農(nóng)業(yè)畜種，其心血管系統(tǒng)、代謝特征、婦科結(jié)構(gòu)及關(guān)節(jié)生理與人類(lèi)高度相似，使其成為心肌梗死、骨關(guān)節(jié)炎、子宮內(nèi)膜異位癥和囊性纖維化等人類(lèi)疾病研究的理想大動(dòng)物模型。然而，傳統(tǒng)培養(yǎng)體系成分復(fù)雜、效率低下且難以維持長(zhǎng)期多能性，嚴(yán)重限制了綿羊在精準(zhǔn)育種和生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中的深入探索。
針對(duì)這一長(zhǎng)期存在的技術(shù)瓶頸，西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院羊遺傳改良與生物育種創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)在國(guó)際權(quán)威期刊《Journal of Advanced Research》上發(fā)表了題為?Efficient derivation of stable sheep embryonic stem cells opens a new avenue for agricultural and biomedical application?的突破性研究成果。該研究成功構(gòu)建了可在體外長(zhǎng)期穩(wěn)定培養(yǎng)的綿羊胚胎干細(xì)胞系，并系統(tǒng)揭示了其分子與表觀遺傳調(diào)控機(jī)制，同時(shí)驗(yàn)證了其在基因編輯中的高效應(yīng)用潛力。
ActRNA:t和sgRNA協(xié)同使用對(duì)靶向鏈進(jìn)行編輯
研究團(tuán)隊(duì)摒棄了以往成分不明確、操作繁瑣的傳統(tǒng)培養(yǎng)體系，創(chuàng)新性地開(kāi)發(fā)出一種名為T(mén)ePR的簡(jiǎn)化培養(yǎng)系統(tǒng)。該體系僅需在商業(yè)化mTeSR? PLUS培養(yǎng)基中添加單一小分子抑制劑IWR-1，即可高效支持綿羊內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的分離與擴(kuò)增。相較于牛、豬等其他家畜常用的需添加4至6種因子的復(fù)雜配方，TePR體系成分清晰、易于復(fù)制，顯著降低了技術(shù)門(mén)檻。利用該體系，研究團(tuán)隊(duì)成功建立了命名為T(mén)ePR-sESCs的綿羊胚胎干細(xì)胞系，建系效率高達(dá)57%，遠(yuǎn)超對(duì)照組的約29%。這些細(xì)胞呈現(xiàn)出典型的緊湊穹頂狀克隆形態(tài)，可在體外連續(xù)傳代超過(guò)100次而保持正常染色體核型和多能性標(biāo)志物表達(dá)，并展現(xiàn)出向三胚層分化的強(qiáng)大潛能。
tsp-pegRNA的設(shè)計(jì)及驅(qū)動(dòng)靶向鏈編輯的模型
為進(jìn)一步解析TePR-sESCs的生物學(xué)本質(zhì)，研究整合了Smart-seq2單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組、ATAC-seq染色質(zhì)可及性分析及全基因組甲基化測(cè)序等多組學(xué)技術(shù)，首次繪制出綿羊從成熟卵母細(xì)胞至囊胚期的早期發(fā)育動(dòng)態(tài)圖譜。分析表明，TePR-sESCs的基因表達(dá)模式最接近于綿羊8細(xì)胞期至桑椹胚階段，恰好對(duì)應(yīng)胚胎基因組激活的關(guān)鍵時(shí)期，提示該細(xì)胞系成功捕獲了早期多能性狀態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)，核心多能性基因如 POU5F1、SOX2 和 NANOG 的啟動(dòng)子區(qū)域具有高度開(kāi)放的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，并富集了相應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)。此外，CTCF這一關(guān)鍵染色質(zhì)架構(gòu)蛋白的結(jié)合基序也顯著富集，暗示其在維持反芻動(dòng)物干細(xì)胞三維基因組結(jié)構(gòu)和多能性網(wǎng)絡(luò)中的重要作用。與此同時(shí)，TePR-sESCs的全基因組DNA甲基化水平高達(dá)約82%，與人類(lèi)、豬和牛的擴(kuò)增潛能干細(xì)胞特征一致，明顯高于囊胚期胚胎，進(jìn)一步印證其處于EGA前后的發(fā)育階段，與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)形成有力互證。
i53在uPEn依賴(lài)的TS編輯中的分子機(jī)制及AZD7648的協(xié)同增效
在功能驗(yàn)證方面，研究團(tuán)隊(duì)利用PiggyBac轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)將mCherry熒光報(bào)告基因高效整合至TePR-sESCs基因組，并通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)獲得穩(wěn)定表達(dá)的單克隆細(xì)胞系。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù)成功敲除肌肉生長(zhǎng)抑制素基因——一個(gè)調(diào)控肌肉發(fā)育的關(guān)鍵負(fù)向因子，證實(shí)該細(xì)胞系能夠耐受多輪復(fù)雜的基因組編輯操作，具備作為基因工程載體的強(qiáng)大可塑性。
這項(xiàng)研究首次實(shí)現(xiàn)了在成分明確、操作簡(jiǎn)便的培養(yǎng)體系下建立長(zhǎng)期穩(wěn)定的綿羊胚胎干細(xì)胞系，攻克了反芻動(dòng)物干細(xì)胞研究中的歷史性難題，為綿羊及其他相關(guān)物種的干細(xì)胞平臺(tái)建設(shè)提供了可靠范式。通過(guò)整合早期胚胎發(fā)育全過(guò)程的轉(zhuǎn)錄動(dòng)態(tài)與干細(xì)胞多組學(xué)數(shù)據(jù)，研究首次系統(tǒng)描繪了綿羊胚胎多能性建立的分子與表觀遺傳全景，深化了對(duì)反芻動(dòng)物早期發(fā)育調(diào)控機(jī)制的理解。更重要的是，TePR-sESCs與現(xiàn)代基因編輯技術(shù)的高效結(jié)合，為綿羊的精準(zhǔn)分子設(shè)計(jì)育種開(kāi)辟了全新路徑，有望顯著提升家畜遺傳改良效率，增強(qiáng)畜牧業(yè)應(yīng)對(duì)糧食安全與氣候變化挑戰(zhàn)的能力。同時(shí)，該成果也為基于綿羊模型的干細(xì)胞治療、疾病機(jī)制研究和再生醫(yī)學(xué)應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)，展現(xiàn)出深遠(yuǎn)的科學(xué)意義與廣闊的應(yīng)用前景。
本論文由西北農(nóng)林科技大學(xué)博士后金妙函、博士研究生黃舒泓及青年教師周世衛(wèi)共同擔(dān)任第一作者，陳玉林教授與王小龍教授為通訊作者。
